哺乳动物细胞蛋白表达纯化服务实验报告案例

本案例基于pAZV5分泌表达体系，使用基因合成的方法构建pAZV5表达载体，瞬时转染HEK293悬浮细胞，通过SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白的表达情况，扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。

一、实验设计 

我们分析客户提供的Target-Gene序列，整个蛋白序列呈亲水性，自身不带信号肽序列，因此我们设计思路为：

1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。

1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，为了保持蛋白的N端活性，我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。

依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pAZ-V5表达质粒，经过测序和酶切验证无误后，挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材

名称 公司 名称 公司

DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂Invitrogen（Gibco）无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、低熔点琼脂糖Sigma公司

抽提试剂盒Axygen公司PCR试剂盒IO-RAD公司

六孔板、细胞培养瓶、离心管corning公司PCR反应管Fisher公司

DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒AXYGEN公司Agarose上海基因公司

中性红碧云天生物公司其它试剂均为国产分析纯

二、主要实验仪器

仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司

Allegra 21R 台式高速冷冻离心机美国BECKMAN公司台式高速离心机德国SORVAL公司Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统美国BIO-RAD公司

PTC-200基因扩增仪美国MJ Research公司320-S pH计美国Mettler Toledo公司AR5120电子天平美国AHOM S公司

MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪美国Amersham Pharmacia公司雪花状制冰机日本SANYO公司JY92-2D超声波细胞粉碎机中国新芝科器研究所

蛋白核酸检测仪南京大学普阳科学仪器厂NANODROP2000美国Thermo公司超净工作台中国苏净集团

四、蛋白性质分析

4.1 客户提供原始基因序列

GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT

4.2 编码的蛋白序列如下（理论分子量41.18KD，理论等电点PI6.73）

GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL

4.3 稀有密码子序列分析如下图所示（红色：使用频率低于10% 灰色：使用频率低于20%，绿色为正常频率密码子）

4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析

4.5 信号肽预测

综上所述：

1、蛋白理论分子量为 41KD，属于正常分子量范围，较适宜表达。

2、通过对基因密码子使用频率的分析，如果以293细胞为表达宿主，基因序列上使用频率低于20%的密码子X个，使用频率低于10%的密码子X个，优化后通过基因合成方式获得目的基因。

3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析，蛋白整体呈亲水性，但从473AA之后，蛋白存在典型的跨膜结构，建议去除后表达以提高成功率。

4、目的蛋白自身无信号肽，添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便，考虑在C端添加His标签。

五、实验方法及实验结果

5.1 pAZ-V5表达质粒构建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，双酶切连接至pAZ-V5载体的Afl II和Xba I之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点，黄色区域为v5信号肽，绿色区域为6XHis标签；

T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G 

5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下：

5.3 pAZ-V5载体图如下所示：

表达条件优化

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18044219133：哺乳动物表达系统有哪些优点和缺点?

苏张：答：表达成本高：相比细菌和酵母等单细胞微生物表达系统，哺乳动物表达系统的表达成本较高。培养细胞、培养基和相关试剂的价格都相对较高，从而增加了表达的成本。处理时间较长：哺乳动物细胞在培养和表达过程中需要较长的时间，通常需要数天到数周甚至更长时间。这对于一些需要迅速得到蛋白质的实验或应用来说...

18044219133：已从某哺乳动物细胞,获得蛋白质A的cDNA序列,并制备好蛋白质A的特异性抗...

苏张：答：丰度的话，先提蛋白然后纯化，跑SDS-PAGE，外加电场转模，加脱脂牛奶封闭，加一抗就是蛋白质A的特异性抗体，带辣根过氧化物酶的二抗，然后孵育，最后观察荧光亮度 定位的话用原位杂交。用cDNA序列制备探针（切口翻译法，末端标记法。。。）

18044219133：蛋白表达实验的整个流程是什么?

苏张：答：蛋白表达实验是一种常用的生物学实验技术，用于大规模合成目标蛋白。以下是蛋白表达实验的一般流程：基因克隆：从感兴趣的源中提取目标蛋白的基因序列，并将其克隆到适当的表达载体上。常用的载体包括质粒和病毒。转染/转化：将重组的表达载体导入到宿主细胞中。对于真核细胞，常用的方法是转染；而对于细菌...

18044219133：高一生物鉴定蛋白质实验报告 [2018高一生物实验报告大全]

苏张：答：高一网权威发布2018高一生物实验报告大全,更多2018高一生物实验报告大全相关信息请访问高一网。 【导语】高一是从初中生物过渡到高中生物的重要时期,也是打好高考生物基础的一个重要时期,我们必须复习好高一的生物实验报告。下面是大范文网为大家整理的高一生物实验报告,希望对大家有所帮助! 实验一 观察DNA和RNA在细胞中...

18044219133：蛋白质在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的基本条件有哪些?

苏张：答：蛋白质表达是以mRNA为模板,氨基酸为底物的.合成场所是核糖体.氨基酸的转运体是tRNA.大肠杆菌是原核细（是一边转录一边翻译）,哺乳动物是真核细胞（转录完成后mRNA出细胞核之后再翻译）.它们的基本条件都是有mRNA、充足的氨基酸、tRNA、核糖体（翻译过程常常形成多聚核糖体,而不是一个核糖体单独工作）另外...

18044219133：哺乳动物细胞表达系统优点缺点有哪些

苏张：答：哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。缺点自然是成本高，制备周期比较长，生长条件复杂，对技术人员要求较高 ...

18044219133：什么是哺乳动物cho细胞表达系统

苏张：答：酵母表达系统的特点：遗传背景清楚，操作较为简便，容易进行遗传操作，有较为完善的真核蛋白表达控制系统；昆虫表达系统特点：细胞表达量高；表达的外源基因片段很大，最大可达到200KD；可实现蛋白的糖基化和磷酸化修饰；投入成本较高。哺乳动物细胞表达系统特点：能诱导高效表达，对表达的蛋白进行正确折叠，...

18044219133：Cell | 桂淼等报道哺乳动物纤毛骨架原子模型并鉴定新的致病基因——从...

苏张：答：2021年，一个国际研究团队，由哈佛医学院的Alan Brown实验室、新加坡国立大学的Sudipto Roy和英国MRC Harwell研究所的Dominic P. Norris实验室联合，桂淼等科学家在Cell杂志上发表了一项突破性成果——《利用冷冻电镜发现哺乳动物纤毛骨架的新致病基因》。他们的研究首次从牛气管组织中分离出运动纤毛的微管...

18044219133：蛋白表达系统的蛋白表达系统分类及优劣分析

苏张：答：酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控。哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，...